Generalidades
1.1 Introducción:
La inmunología es la ciencia biológica que estudia todos los mecanismos fisiológicos de defensa de la integridad biológica del organismo. Dichos mecanismos consisten esencialmente en la identificación de lo extraño y su destrucción.
----Imagen Historia de la inmunología Línea cronológica-----
En las últimas décadas, se han introducido procedimientos analíticos basados en las reacciones inmunológicas que se creían propias de los seres vivos, los cuales han representado un importante avance en el análisis de sustancias de interés en biología animal y vegetal difíciles de medir empleando los métodos bioquímicos habituales. Estos métodos analíticos se conocen como inmunoensayos. Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac (inmunocomplejo).
1.2 Conceptos
Inmunoensayos
Son métodos analíticos que usan complejos de anticuerpo y antígeno (inmunocomplejos) para medir la presencia de un analito específico en una muestra. Debido a que los antígenos y anticuerpos se definen por sus interacciones mutuas, uno de ellos puede utilizarse para cuantificar al otro. Aunado a ello, la propiedad que tienen las Igs (anticuerpos) de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos, hacen que estos métodos se empleen ampliamente.
En las reacciones antígeno-anticuerpo primarias, no se generan productos que faciliten distinguir o validar si la reacción se ha llevado a cabo o no, por lo que es necesario introducir algún indicador que permita proporcionar una señal que dará paso a la cuantificación y posterior interpretación. Estos indicadores, conocidos como marcadores, se unen de manera dirigida a los antígenos o anticuerpos por unión covalente, permitiendo así el revelado de la reacción. Los marcadores pueden ser de naturaleza diversa; pero, posiblemente, los más usados en este grupo de técnicas son los fluorocromos, los isótopos radiactivos, las enzimas y las nanopartículas coloreadas.
Figura 1. Los anticuerpos marcados permiten la detección de complejos antígeno/anticuerpo en inmunoensayos
Figura 2. El antígeno marcado también permite la detección de complejos antígeno/anticuerpo en los inmunoensayos
Tabla 1. Principales métodos analíticos basados en la unión Ag-Ac.
Anticuerpo son proteínas que normalmente produce el sistema inmunológico en respuesta a una sustancia extraña.
Figura 3. Inmunoglobulinas humanas.
Antígenos son las moléculas a las que se unen los anticuerpos, que en el cuerpo podrían ser un un agente patógeno invasor, o cualquier molécula extraña que provoque una respuesta inmunológica.
Figura 4. Antígeno-Anticuerpo
Enzimas. Compuestos de naturaleza proteica que facilitan que las reacciones bioquímicas llevadas a cabo en condiciones fisiológicas de concentración y temperatura puedan realizarse a la velocidad adecuada.
Figura 5. Estructura clásica de una enzima proteica.
Haptenos: grupos químicos que por sí mismos no desencadenan formación de anticuerpos, pero sí lo hacen tras ser conjugados a proteínas portadoras
Figura 6. Haptenos
Clasificación de los inmunoensayos
Figura 7. Clasificación de los inmunoensayos.
En los inmunoensayos competitivos: La concentración de antígeno (analito) es inversamente proporcional a la concentración de la señal.
Si quiere valorarse la presencia de un antígeno en una muestra, se le añade el anticuerpo correspondiente y una cantidad conocida del mismo antígeno marcado, denominado patrón, de manera que ambos antígenos, marcado –patrón– y no marcado –presente en la muestra– compiten en su interacción con el anticuerpo. Después de dejar que ocurra la reacción, se valora la cantidad de patrón que ha quedado libre.
Figura 8. Esquema de inmunoensayos competitivos.
Figura 8.1 Proceso de los inmunoensayos competitivos.
En los inmunoensayos no competitivos, la concentración de antígeno (analito) es directamente proporcional a la concentración de la señal.
Para determinar en la muestra problema (suero) la cantidad de un antígeno, se enfrenta a un anticuerpo marcado. Cuanto mayor sea la cantidad del antígeno presente en la muestra, más anticuerpos marcados se unirán a él para formar inmunocomplejos, con lo que se establece una correlación directamente proporcional.
Figura 9. Esquema de inmunoensayos no competitivos.
Figura 9.1 Proceso de los inmunoensayos no competitivos.
Inmunoensayo homogéneo: no se realiza la separación de moléculas libres. Son, en general, procedimientos más sencillos que suelen utilizarse en la determinación de sustancias de bajo peso molecular y de concentración considerable.
Se basa en los cambios de la actividad enzimática, un hapteno es unido a la enzima de tal forma que altera su actividad cuando el hapteno se une al anticuerpo.
Ventajas; ensayo específico, sensible, de amplia aplicación, equipo requerido barato y disponible, reactivos baratos y de vida media-larga, potencialmente se puede automatizar y no tiene peligro de radiación. El compuesto marcado presenta un comportamiento diferente según se halle o no unido a un anticuerpo. No requieren separación física de las fracciones ligadas (Ac-Ag*) y libres (Ag*) antes de la medición se desarrollan en fase líquida.
Inmunoensayo heterogéneo: En ellos, es preciso separar los inmunocomplejos formados de las moléculas que queden libres. Para ello, los reactivos van en fase sólida (como una partícula magnética o una esfera plástica) y la separación de las moléculas libres se consigue mediante lavados. Son técnicas adecuadas para determinar sustancias de alto peso molecular (mayor a los 10,000 Daltons).
Figura 10. Proceso de los inmunoensayos homogeneos y heterogeneos.
Fundamentación de los principales inmunoensayos.
3.1 RIA
En el radioinmunoensayo se cuantifica la radioactividad en forma de complejos antígeno-anticuerpo.
Figura 11. Los radioinmunoensayos (RIA) utilizan una marca de isótopo radioactivo.
El radioinmunoanálisis (RIA), facilita el análisis de moléculas presentes en baja concentración en suero, ya que es un método muy específico y sensible.
Es una técnica con un fundamento bastante sencillo, puede seguir dos estrategias: directa o competitiva e indirecta o no competitiva.
En el radioinmunoanálisis competitivo, se utiliza un antígeno marcado, denominado trazador. El trazador competirá con el antígeno presente en la muestra (cuya concentración es lo que ha de valorarse). Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno no marcado, menor será el trazador que se una al anticuerpo.
El radioinmunoanálisis no competitivo utiliza anticuerpos marcados que se unirán al antígeno por valorar. De manera que, a más antígeno presente en la muestra problema, más anticuerpo marcado quedará unido y mayor nivel de radiactividad se registrará.
3.2 Técnicas inmunoenzimáticas
Se basan en la detección de una reacción antígeno-anticuerpo, esto se hace generalmente mediante un cambio de color o la emisión de luz, producidos por la interacción de la enzima y su sustrato. Ambos efectos son cuantificables y proporcionales a la intensidad de la interacción.
3.2.1 ELISA
El ensayo de ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente enzimático, por sus siglas en inglés) es una técnica inmunoenzimática en la cual se busca detectar a los complejos Ag-Ac mediante el uso de enzimas. Las cuales pueden estar unidas al Ag o al Ac; y se evidencían por la reacción de la enzima con su sustrato específico.
Si lo que se desea es detectar anticuerpos en la muestra sanguínea del paciente, se usa el antígeno correspondiente.
Se pone en un tubo o sobre un papel especial absorbente.
Se agrega el suero sanguíneo del paciente.
Los Ac se combinan con el Ag
Para revelar la reaccion se agrega un anticuerpo anti-gammaglobulina el cual ha sido combinado químicamente con una enzima- Este se pega al anticuerpo que se adhirió al primero, lo podríamos saber si agregamos el sustrato correspondiente a las enzimas que contienen el segundo anticuerpo.
Habitualmente el sustrato es incoloro, pero al alterarlo la enzima se colorea, descubriendo así, que el segundo anticuerpo está ahí unido sobre el primer anticuerpo, por lo cual se sabe que el paciente si tiene anticuerpo para el antígeno que pusimos a prueba.
( Video ELISA)
https://www.youtube.com/watch?v=iscfTcU8l3A
Video de Tipos de ELISA
https://www.youtube.com/watch?v=P7v89ke_i9Y
Clasificación de los inmunoensayos ELISA
ELISA directo
Es el ensayo ELISA más simple y rápido de todos, donde un anticuerpo primario marcado con una enzima se unirá directamente al antígeno de interés permitiendo la detección y/o cuantificación del mismo.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
El antígeno se inmoviliza sobre una placa.
Se añade un anticuerpo primario marcado con una enzima que se unirá al antígeno de interés.
Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
Figura 12. Principio básico de la técnica de ELISA directo.
Video https://www.youtube.com/watch?v=fxyHClJ3sgo
ELISA indirecto
Es un ensayo parecido al ELISA directo pero en dos pasos, lo que permite amplificar la señal obtenida. En este caso se utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro secundario, y es este último el que irá conjugado a una enzima. El Ac conjugado o secundario, se une al Ac primario (es un “anti-anticuerpo”) y evidencia la reacción mediante la adición del sustrato específico de la enzima, provocando una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del Ag de interés.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
El antígeno se inmoviliza sobre una placa.
Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno de interés.
Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario.
Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
Figura 13. Principio básico de la técnica de ELISA indirecto
Video https://www.youtube.com/watch?v=KrGC0ZgIDI8
ELISA tipo sándwich
En el ELISA tipo sándwich el antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de captura y otro de detección también conocidos como pares de anticuerpos, que se unirán a dos epítopos distintos de un mismo antígeno.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
El anticuerpo de captura se inmoviliza sobre la placa.
Se añade la muestra que contiene el antígeno de interés que se unirá al anticuerpo de captura.
Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antígeno unido a su vez al anticuerpo de captura.
En caso de que el anticuerpo de detección vaya conjugado a una enzima, procederemos directamente con el 5º paso. En caso contrario (que es lo más habitual en los ELISA tipo sándwich), será necesario añadir un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo de detección.
Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
Figura 14. Principio básico de la técnica de ELISA sandwich.
Video https://www.youtube.com/watch?v=FmVV4e8evc8
ELISA competitivo
El ELISA competitivo es una variante más compleja de la técnica ELISA, también conocido como ELISA de inhibición debido al uso de un antígeno de referencia que competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo primario.
Se utiliza generalmente para detectar y/o cuantificar antígenos presentes en muy bajas cantidades.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antígeno de interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-anticuerpo.
Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo.
Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles.
Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario anclado al antígeno de referencia.
Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de interés presente en la muestra.
Figura 15. Principio básico de la técnica de ELISA competitivo.
https://www.abyntek.com/tipos-de-elisa/
Video https://www.youtube.com/watch?v=QVENKRW4fXk
3.2.2 EMIT. Enzyme multiplied immunoassay
El EMIT es un inmunoensayo con mayor aplicación en el análisis de fármacos o drogas de abuso, determina moléculas de bajo peso molecular, técnica con buena sensibilidad pero baja especificidad.
Se fundamenta en el marcaje de una enzima con el antígeno (Ag) a determinar, formando un complejo. La unión del anticuerpo (Ac) a este complejo inhibe la actividad catalítica de la enzima, al impedir el acceso del sustrato al centro activo. La competencia entre el Ag de la muestra y el Ag ligado a enzima por el anticuerpo, implica que a mayor concentración de Ag presente en la muestra, menor cantidad de enzima será inactivada, por lo que la actividad es directamente proporcional al Ag del espécimen. Después al adicionar el sustrato y se una al complejo, emite una señal que se mide a los 15 y 45 segundos, y el cambio en la absorbancia se convierte en una lectura de concentración.
Imagen 16. Inmunoanálisis con enzimas multiplicadas EMIT. 1: Complejo Ag-enzima + Ag de la muestra + Ac. 2: Competencia por Ac entre Ag de la muestra y complejo Ag-enzima. 3:Complejo Ag-enzima unido al sustrato. 4: Señal de absorbancia emitida por el sustrato unido al complejo.
3.3 FPIA
Inmunoensayo por Polarización de Fluorescencia (FPIA), Es un tipo de inmunoensayo homogéneo competitivo por fluorescencia.
Con la unión competitiva, el antígeno de una muestra y el reactivo marcado antígeno-fluoresceína (AgF) compiten por los puntos de unión en el anticuerpo. Como inmunoensayo homogéneo, la reacción se lleva a cabo en una solución de reacción simple, y el complejo Ab-AgF no requiere un paso de lavado para separarlo de la marca AgF “libre”.
Figura 17. Inmunoensayo competitivo por polarización de fluorescencia (FPIA).
Al incidir la luz emitida sobre el trazador, lo eleva a un estado de excitación, tras el cual dicho trazador vuelve a estado de equilibrio emitiendo luz verde (525-550 nm). Cuando la fluoresceína está ligada a una molécula de anticuerpo de gran tamaño, su rotación en el seno de la muestra disminuye y permite que la emisión de luz verde sea en el mismo plano de polarización que la radiación recibida, mientras que si dicho fluoróforo está unido sólo al antígeno (de pequeño tamaño) la rotación es rápida y cuando emite luz verde lo hace ya en otro plano de polarización.
Todo esto implica que cuanto mayor sea la concentración de antígeno (sustancia a medir) en la muestra, menor será la polarización detectada debido a que existirán menos uniones anticuerpo-antígeno-trazador.
También se deduce del funcionamiento de dicha técnica, que se emplea solamente para moléculas de bajo peso molecular, para que no interfiera su tamaño o en una menor rotación del antígeno-trazador libre.
3.4 Nefelometría
Esta técnica se basa en la detección de los complejos Ag-Ac, por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados.
Figura 18. Esquema de nefelómetro. Los complejos Ag-Ac formados son cuantificados por el grado de difracción.
4. Bibliografía
Global Marketing: Inmunoquímica. Introducción a los Inmunoensayos [Internet] [Consultado el 16 de enero del 2021]. Disponible en:
http://www.alergomed.org/uploads/1/0/0/2/10021998/lectura_prctica_-_inmunoensayos_1.pdf
Natividad Montes Barqueros. Técnicas de inmunodiagnóstico [Internet] [Consultado el 16 de enero del 2021]. Disponible en:
https://www.sintesis.com/data/indices/9788491711452.pdf
Romero R. Microbiología y parasitología humana.México: Editorial Médica Panamericana; 1994.
Koivunen M. Krogsrud L. Principles of Immunochemical Techniques Used in Clinical Laboratories. LABMEDICINE. 2006. 37(8): 490-497.
Fernández C. Rodelgo L. Ruiz M. Guiz G. El laboratorio clínico y la función hormonal. Preanalítica, analítica, postanalítica y calidad. [Internet]. España: LABCAM. 2011 [Consultado 16 de enero del 2021]. Dsiponible en: https://www.researchgate.net/publication/257997239_El_laboratorio_clinico_y_la_funcion_hormonal_Preanalitica_analitica_postanalitica_y_calidad
Payes F. Técnicas Inmunológicas Primarias [Internet]. 2014[consultado 16 de enero del 2021]. Disponible en:
O., F (2012). Técnicas inmunoenzimáticas para ensayos clínicos de vacunas y estudios inmuno epidemiológicos. Finlay Ediciones. https://www.paho.org/cub/index.php?option=com_docman&view=download&category_slug=casas-editoriales&alias=742-pubfinlay-librotecinmunoparaeclinvacunas2012&Itemid=226
A.(2019,27 junio). Tipos de ELISA, ¿conoces las diferencias? Abyntek Bioharma https://www.abyntek.com/tipos-de-elisa/
Instituto de biotecnología. Inmunoquímica. UNAM, 2007. [consultado el 16 de enero de 2021] disponible en:
http://oldwww.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf
