EQUIPO

RIA 
(Radioinmunoensayo)

Introducción a los Inmunoensayos

http://www.alergomed.org/uploads/1/0/0/2/10021998/lectura_prctica_-_inmunoensayos_1.pdf

Los equipos utilizados en este tipo de ensayo son: 

Figura 1. Analizador de Centelleo (Contador gamma)

Figura 2. Diagrama de mecanismo del Contador Gamma para Radioinmunoensayo

Figura 3. Diagrama de Contador Gamma para Radioinmunoensayo

Componentes Esenciales:

• Detector Cristal Yoduro de sodio activado con talio: Es el emisor de fotones, materia del destello de cavidad cilíndrica en donde se coloca la muestra. 

• Blindaje de plomo: Protección para el detector de cristal yoduro de sodio, evita interferencias por fuentes radiactivas presentes en el área o de radiaciones provenientes en el medio ambiente.

• Tubo fotomultiplicador: Captador de los destellos luminosos para transformarlos en impulsos eléctricos.  

• Amplificador: Incrementa y el tamaño y el impulso eléctrico 

• Analizador (discriminador):Identifica y separa los impulsos eléctricos que no son de interés en la medición.

• Escalador o lector: Detecta el número de impulsos eléctricos que fueron recibidos en un periodo de tiempo

Lectura:

En el RIA competitivo, ha de enfrentarse la muestra por valorar a la que se le añadió el trazador al anticuerpo que reconozca el antígeno que es el analito por cuantificar buscado. Pasada la reacción, se lavan los complejos y se valora el grado de reactividad presente en ellos, que será menor cuanto mayor fuera el analito presente en la muestra. Normalmente, existirán curvas de calibrado que permita enfrentar el grado de radiactividad con la concentración. 

Por el contrario, en un ensayo de RIA no competitivo, el nivel de radiactividad detectado tras los oportunos lavados será proporcional a la concentración del antígeno valorado. 

Aplicaciones en el área de farmacia clínica:

El desarrollo de esta técnica de laboratorio permitió un gran avance en los estudios endocrinológicos, puesto que las hormonas están presentes generalmente en bajas concentraciones y su determinación en muestras era difícil.

•  Permite la determinación cuantitativa del orden de nanogramos y picogramos de unas 200 substancias de estructuras complejas en fluidos biológicos, muchas de las cuales no son cuantificables mediante métodos comunes. 

• Se utiliza ampliamente en análisis clínicos para determinar la concentración de una gran variedad de substancias de interés médico en muestras de pacientes.

• Área de endocrinología, permite estudiar detalladamente los diferentes mecanismos de regulación hormonal,vitaminas, neuropéptidos. 

Material complemento:

• Determinación de leptina y sus valores séricos en alpacas hembras adultas con diferente condición corporal: 
  http://www.scielo.org.pe/scielo.php?pid=S1609-91172007000200005&script=sci_abstract

ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas)

Equipos utilizados:

• Lector de microplacas de Elisa

Es un espectrofotómetro especializado, diseñado para efectuar la lectura de los resultados de una técnica que se utiliza para determinar la presencia de anticuerpos o antígenos específicos presentes en una muestra.     

Figura 4. LECTOR DE ELISA / DIATEK – DR-200BS

Cuadro 1. Características técnicas del equipo.

Tipo de microplaca	98/48 pocillos por placa.
Fuente de luz	8V/50W lámpara halógena de tungsteno controlada.
Filtros estándares	405, 450, 492, 630 nm.
Impresora	Impresora interna térmica, opcional a externa.
Fotodetector	Fotodiodo de silicio
Resolución	0.001A
Precisión	±0.008A
Reproducibilidad	≤0.2%
Estabilidad	±0.003A
Rango de lectura	0.000 – 4.00 A
Velocidad de lectura	Longitud de onda simple ≤3s, longitud de onda doble ≤6s.

Componentes Esenciales:
Microplacas: Placa con múltiples pocillos que se utiliza para análisis clínicos y microbiológicos.
Fuente de luz: Emisor constante de radiación electromagnética para excitar a los electrones de una sustancia para que pueda emitir una onda. 
Filtros estándares: Deja pasar los los componentes deseados (longitudes de onda deseados)
Fotodetector: Detecta los fotones que no fueron absorbidos, convierte la señal transmitida en corriente eléctrica. 
Lector: Percibe la señal transmitida por el detector, para su evaluación. 

Principios de operación

A diferencia de los espectrofotómetros convencionales que efectúan lecturas en rango amplio de longitudes de onda, este dispone de filtros o rejillas de difracción que limitan el rango de longitudes de onda a aquellas que se utilizan en la técnica ELISA, la cual generalmente se realiza con longitudes de onda comprendidas entre los 400 y los 750 nm.

Algunos analizadores operan en el rango ultravioleta y pueden efectuar análisis entre los 340 y los 700 nm. 

El sistema óptico utiliza la fibra óptica para llevar la luz hasta los pozos de la placa, donde se encuentra la muestra bajo análisis. La luz que atraviesa la muestra tiene un diámetro que varía entre 1 y 3 mm. Un sistema de detección recibe la energía lumínica, proveniente de la muestra, la amplifica, determina la absorbancia y, a través de un sistema de lectura, la convierte en datos que permiten interpretar el resultado de la prueba. 

También hay analizadores de ELISA que emplean sistemas lumínicos de doble haz. Las muestras del ensayo de ELISA se colocan en placas de diseño especial, las cuales disponen de un número definido de pozos o vasos, en los cuales se lleva a cabo el procedimiento o ensayo. 

Son comunes las placas de 8 columnas por 12 filas, con un total de 96 pozos. También existen placas con un mayor número de pozos. Hay 384 pozos y la tendencia actual busca aumentar el número de pozos, y reducir la cantidad de reactivos y el volumen de las muestras requeridas. La ubicación de los sensores ópticos en el analizador de ELISA varía dependiendo de los fabricantes. Algunos los colocan sobre la placa portamuestras, mientras que otros los ponen directamente bajo los pozos de la placa.

En la actualidad, los analizadores de ELISA disponen de controles regulados por microprocesadores, interfases de conexión a sistemas de información, programas de control de procesos y control de calidad que, a través del computador, permiten la automatización completa de los ensayos requeridos.

• Lavador de ELISA

El equipo efectúa el lavado de los pozos que contienen las placas de ELISA, durante las diferentes etapas de la técnica.

Figura 5. Lavador de ELISA- YB Valdivias

Figura 6. Partes fundamentales del equipo "ELISA"

Componentes Esenciales:

1. Soporte de placa: Es el lugar donde se coloca la placa a la que se le realizará el lavado.
2. Cabeza del dispensador: Se encarga de distribuir uniformemente el líquido en los pocillos para extraer los residuos. 
3. Cabeza de aspiración: se introduce en los pocillos para extraer los residuos. 
4. Frasco con solución de lavado: En él se deposita la solución de lavado para los pocillos. 
5. Soporte de frascos de solución de lavado
6. Mangueras: Hechas de silicón para la interconexión de los diferentes elementos del sistema.
7. Mangueras: Hechas de silicón para la interconexión de los diferentes elementos del sistema.
8. Panel de control: Se encuentra el teclado, display y los indicadores lumínicos que en conjunto facilitan el intercambio de información con el operario. 
9. Entrada de alimentación: Entrada de alimentación de energía eléctrica.
10. Fusibles 
11. Interruptor de incendio
12. Orificio de escape de presión
13. Comunicador de serie

Propósito del lavador de ELISA

Proporcionar, de forma controlada, los buffers de limpieza que se requieren al desarrollar un análisis utilizando la técnica de ELISA. Asimismo, retira de cada uno de los pozos las sustancias que no participaron en la reacción.

Principios de operación

El equipo dispone de al menos los siguientes subsistemas que varían en diseño dependiendo del fabricante:

• Subsistema de control.
  controlado por microprocesadores y permite:
  programar y controlar las actividades que debe realizar el lavado como el número de ciclos de lavado requeridos, los tiempos de espera, las presiones de suministro y de extracción, el tipo de placa utilizada (96-384 pozos); ajusta la función de succión según la forma del pozo -fondo plano, fondo en V, fondo redondo o tiras utilizadas-; regula los volúmenes dispersados y/o aspirados, los tiempos de remojo y agitación, entre otros.

• Subsistema de suministro.
  Compuesto por un depósito para la solución de lavado, una o varias bombas, usualmente de desplazamiento positivo tipo jeringa y una cabeza dispensadora que suministra, a través de agujas, la solución de lavado a los diferentes pozos.
  La cabeza suele contar con ocho pares de agujas para lavar y aspirar los pozos de una misma fila de la placa de forma simultánea –en la cabeza confluyen los subsistemas de suministro y de extracción–.

• Subsistema de extracción:
  Requiere de un mecanismo de vacío y de un sistema de almacenamiento para recolectar los fluidos y desechos retirados de los pozos de las placas. El vacío puede ser proporcionado por bombas externas o internas. La extracción se realiza mediante un conjunto de agujas montadas en la cabeza lavadora/aspiradora. El número de agujas varía entre uno y tres, según el fabricante y el modelo.

• Subsistema de avance:
  Compuesto por un mecanismo que desplaza horizontalmente la cabeza de suministro y extracción, para poder llegar en la placa de ELISA a cada uno de los pozos; cuando se ha efectuado el desplazamiento horizontal a la siguiente fila, se realiza un movimiento vertical hacia los pozos, con el fin de dispensar y/o extraer la solución de lavado. 

Hay lavadores que efectúan estas operaciones de forma simultánea. Se presenta a continuación una ilustración en la que se muestran los subsistemas mencionados.

Figura 7. Partes fundamentales del equipo "ELISA"

Figura 8.  Formas de pozo más comunes encontradas en las placas de ELISA

Figura 9.  Forma en que se encuentran interrelacionados los equipos mencionados.

Uso de equipos

Cuando se realiza una prueba de ELISA, generalmente se siguen estos pasos:

1. Utilizando el lavador de ELISA o microplacas, se efectúa un primer lavado de la placa.

2. Mediante el dispensador de líquidos o las pipetas multicanal, se llenan los vasos o pozos de las placas con las soluciones preparadas para ser utilizadas en el ensayo.

3. A continuación, se coloca la placa en la incubadora donde, a temperatura controlada, se lleva a cabo un conjunto de reacciones.

Las etapas 1, 2 y 3 se pueden repetir varias veces dependiendo del ensayo, hasta que se logre que las muestras colocadas en las placas hayan terminado sus reacciones.

4. Finalmente, cuando se han completado las reacciones químicas, se lleva la placa al analizador de ELISA y se efectúan las lecturas que permiten emitir un diagnóstico.

Aplicaciones en el área de farmacia clínica:

• Detección de  infección o una enfermedad autoinmune

• Detección de enfermedades causadas por virus

• Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica, Leucemia. 

• Detección de enfermedades causadas por bacterias

• Mycobacterium tuberculosis, bruselas, Estreptococos, Salmonella

• Detección de enfermedades producidas por parásitos

• Toxoplasmosis, Triquinosis, Trypanosoma.

• Otras aplicaciones

• Hormonas (HCG, Progesterona, Testosterona)

• Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)

• Inmunopatología (Factor reumatoide, inmunocomplejos circundantes)

Material complemento:

• Conceptos básicos de la técnica ELISA. Protocolo del ELISA en Sandwich:
  https://www.youtube.com/watch?v=GE8JlP0PBEM&feature=youtu.be
• Desarrollo y validación de un inmunoensayo para la detección de la leptina caprina: 
  https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0301-732X2015000300007
• IC: Uso de lector de placas de 96 pocillos: 
  https://www.youtube.com/watch?v=hn1DMZjbU60&feature=youtu.be
• Lector de Microplaca Thermo Scientific Multiskan FC: 
  https://www.youtube.com/watch?v=tjB2XVy1OgA&feature=youtu.be

EMIT (Ensayo inmunológico por multiplicación enzimático)

El Equipo Viva-E® Systeme para ensayo inmunológico por multiplicación enzimático. Este sistema es fácil de usar y está diseñado para satisfacer las necesidades de pruebas de drogas.

El Sistema Viva-E ® procesa patrón oro Syva ® EMIT ® reactivos para análisis farmacológico (TDM), monitorización de fármacos inmunosupresores (ISD), las drogas de las pruebas de abuso (DAT), así como la realización de pruebas de validez de las muestras.

 Es Rápida y flexible

* Resultados en tan sólo 10 minutos

* Hasta 130 pruebas por hora EMIT

Rango fotométrico -0,1 A 3,0 Absorbancia

Gasto de muestra Volumen de muestra 1 - 30 µl por prueba, programable en pasos de 0,1 µl

Total de muestra mínimo a poner Volumen de medición mínimo 220 µl

Sensibilidad: Límite analítico 40 ng/ml y funcional : < 350 ng/mL

Figura 10.  Equipo Viva-E® System para ensayo inmunológico por multiplicación enzimático

Componentes Fundamentales:

• Fuente de luz: Emisor constante de radiación electromagnética para excitar a los electrones de una sustancia para que pueda emitir una onda.

• Monocromador: Separador de la radiación electromagnética en longitudes de onda e identificarla. 

• Fotodetector: Detecta los fotones que no fueron absorbidos, convierte la señal transmitida en corriente eléctrica.

• Lector: Percibe la señal transmitida por el detector, para su evaluación. 

• Rotor: Un rotor que combina las posiciones de muestra y reactivo

• Anillo de rotor interior:Para botellas de reactivo a refrigeración de 8-12 °C 

• Anillo de rotor exterior: Para botellas de reactivo a temperatura ambiente.

• Reactivo y aguja de muestra precalentados con detección de nivel y mezclador integrado

• Cargador  continuo  de muestras

Aplicaciones en el área de farmacia clínica:

Determinación de concentraciones de fármacos

• Acetaminofen 

• Amicacina

• Carbamazepina

• Digoxina

• Gentamicina

• Metotrexato

• Fenobarbital

• Fenitoína 

• Quinidina

• Ácido Acetilsalicílico

• Teofilina

• Tobramicina

• Ácido Valproico

• Vancomicina

• Determinación de concentraciones de drogas

• 6-acetilmorfina

• Alcohol

• Anfetaminas

• Barbitúricos

• Barbitúricos Tox. en suero 

• Benzodiazepinas 

Benzodiazepinas Tox. en suero

Buprenorfina

Cannabinoides

Metabolitos de cocaína 

Éxtasis

Metadona

Metacualona

Opiáceos 

Oxicodona

LSD

Fenciclidina

Propoxifeno

• Abuso e intoxicación por marihuana (cannabinoides).

Material complemento:

• Comparación del análisis inmunoenzimático y la cromatografía de líquidos de alta eficiencia (EMIT y HPLC) para la medición de carbamacepina en muestras séricas: 
  https://www.medigraphic.com/pdfs/salmen/sam-2001/sam015c.pdf
• Siemens Viva-E:
  https://www.youtube.com/watch?v=1Guol9e8TEs&feature=youtu.be

FPIA

(Inmunoensayo de polarización fluorescente)

Figura 11.  Equipo TDx de ABBOT

Este es un equipo de la casa comercial Abbott, basado en la tecnología fluorescencia polarizada (FPIA), ampliamente conocido desde el punto de vista tecnológico a nivel mundial, es el primer equipo diseñado para monitoreo automatizado de drogas, tanto de uso terapéutico, como de abuso. Su rango y su categoría de confiabilidad técnica, está ampliamente reconocido en la literatura internacional (comparable estrechamente a métodos de referencia como es el HPLC).

 

Figura 12. Diagrama general de un fluorímetro

Fluorímetro

Un fluorímetro consta de una fuente de luz y de un sistema de selección de longitud de onda de excitación. Cuando la muestra es excitada con radiación de energía apropiada emite radiación en todas las direcciones del espacio. No obstante, la luz emitida se detecta mejor en ángulo recto con respecto al haz de excitación ya que se evitan problemas de dispersión de la luz y también el haz de luz excitante que es de mucha mayor intensidad que el haz de luz emitida. La luz emitida es recogida seleccionando una longitud de onda apropiada y conducida a un detector donde queda registrada por sistemas similares a los de un espectrofotómetro de absorción.

Componentes Esenciales

• Fuente de luz: Emisor constante de radiación electromagnética para excitar a los electrones de una sustancia para que pueda emitir una onda.

• Selector de longitud de onda  de entrada: Separador de la radiación electromagnética en longitudes de onda a la cual los electrones se excitarán.

• Muestra:Se coloca la sustancia que desea analizar.

• Selector de longitud de onda  de salida: Selecciona la longitud de onda en la que el producto va a fluorescer.

• Detector:Detecta los fotones que no fueron absorbidos, convierte la señal transmitida en corriente eléctrica.

• Registrador: Percibe la señal transmitida por el detector, para su evaluación.

  PRECAUCIONES

Utilizar cubetas de cuarzo, porque el vidrio blanco tiene una fluorescencia elevada.
La limpieza debe realizarse con detergentes no fluorescentes.
Los reactivos que se utilicen en estas determinaciones no deben estar en contacto con tapones de goma negra.
Las muestras que van a ser leídas no deben presentar burbujas de gas, sólidos suspendidos o enturbiamiento.

 INTERPRETACIÓN
Los resultados de FPIA se muestran como una curva inversa por cuanto a valores bajos de analito del paciente producen una señal más alta (en este caso, la señal es luz polarizada). Una señal alta a niveles bajos de analitos del paciente dan como resultado un ensayo muy sensible

CARACTERÍSTICAS DE LA TÉCNICA
Su tecnología de detección se realiza por química húmeda.
Utiliza como reactivo líquido la fluoresceína.
Su equipo de lectura es el fluorómetro.

Aplicaciones en el área de Farmacia Clínica.

• Se utiliza para proporcionar una medición exacta y sensible de pequeños analitos de toxicología como pueden ser las drogas terapéuticas, y las drogas de abuso y algunas hormonas.
• Pruebas realizadas: Drogas de abuso (marihuana, cocaína,benzodiacepinas)
  Drogas inmunosupresoras (ciclosporina, tacrolimus, sirolimus) 3. hormonas (cortisol tiroxina, testosterona)
  Vitaminas (vitamina b 12 vitamina a vitamina d).

Material complemento:

• Therapeutic carbamazepine (CBZ) and valproic acid (VPA) monitoring in children using saliva as a biologic fluid:
  
  https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1676-26492008000200003&script=sci_abstract&tlng=es

REFERENCIAS 

•  Introducción a los inmunoensayos [Internet]. inmuno chemistry diagnostic; 2020 [citado 16 enero 2021]. Disponible en: http://www.alergomed.org/uploads/1/0/0/2/10021998/lectura_prctica_-_inmunoensayos_1.pdf 

• Venegas R. Estudio comparativo del Manejo de datos de  RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA) [licenciatura ]. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO; 1986.

• Montes Barqueros N. Técnicas de inmunodiagnóstico [Internet]. España : Editorial síntesis ; 2020 [citado 16 enero 2021]. Disponible en: https://www.sintesis.com/data/indices/9788491711452.pdf 

• Importador de equipos médicos y laboratorio [Internet]. I.E Medic.S.A.C. 2021 [citado 16 enero 2021]. Disponible en: http://iemedic.com.pe/producto/lector-de-elisa-dr-200bs-diatek/

• Manual de mantenimiento para equipos de laboratorio [Internet]. Washington D.C.: Organización panamericana de la salud ; 2005 [citado 16 enero 2021]. Disponible en: https://www.academia.edu/38835159/Manual_de_mantenimiento_para_equipos_de_laboratorio 

• ELISA Enciclopedia médica . (2020). consultado 15 de enero de 2021, de AARP website: https://healthtools.aarp.org/es/health/elisa

•  Manual de usuario lavador automático. [Internet] paho [citado 22 enero 2021] Disponible en: https://www.paho.org/cub/index.php?option=com_docman&view=download&category_slug=centro-de-inmunoensayo&alias=345-bio-cie-lavadorautomatico-manual-mw-2001-v2-i-00&Itemid=226

• Sistema Viva-Jr [intenet]Siemens Healthineers;2021 [citado 22 enero 2021]. Disponible en: https://www.siemens-healthineers.com/ve/drug-testing-diagnostics/viva-drug-testing/viva-jr-drug-testing-system

• Control y determinación de las concentraciones de un fármaco. [internet] Beackman Coulter; 2021. [ Citado 22 enero 2021 ]. Disponible en: https://www.beckmancoulter.com/es/products/chemistry/drug-monitoring-and-detection

• Espectroscopía de fluorescencia [Internet] Universitas Miguel Hernández; 2021 [Citado 22 enero 2021] Disponible en : https://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/Miguel_Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_06.htm